настоящая индивидуалка спб Иммунология и защита иммунитета. Значение вакцинации для профилактики заболеваний, >> Смешанная культура лимфоцитов. Методика

Главная


настоящая индивидуалка спб

Смешанная культура лимфоцитов. Методика

Материалы и оборудование. См. разделы «Разделение клеток иммунной системы» и «Реакция бласттрансформации лимфоцитов. Методика». Кроме того, необходимы низкотемпературный шкаф, ДМСО, биокамера ВО 100, жидкий азот, сухой лед, полиэтиленовые пробирки, для инактивации клеток митомицин С или кобальтовая пушка.

Проведение анализа

Если СКЛ применяют для общей оценки функции Т-клеток, то для стимуляции используют смесь аллогенных клеток. Если подбирают пару донор — реципиент, то оценивают силу реакции прежде всего донора. Подробнее см. рисунок.

Этапы работы при получении смешанной культуры лимфоцитов для оценки иммунореактивностн, в частности для выбора пары донор — реципиент

Этапы работы при получении смешанной культуры лимфоцитов для оценки иммунореактивностн, в частности для выбора пары донор — реципиент

Ли —лимфоцит; ШГО — шкаф глубокого охлаждения; ф — фон; ЛД — лимфоциты донора; ПКС — пул клеток стимуляторов;
обработка и измерение описаны в разделе «Реакция бласттрансформации лимфоцитов. Методика».

Инактивация клеток-стимуляторов: 30 Гр дают при помощи кобальтовой пушки с нагрузкой 2,5—12,5х10-2 Ки/кг. Если отсутствует источник радиации, клетки можно инактивировать добавлением 50 мкг радиоактивного материала на каждый мл суспензии клеток (30 минут, 37°С). После этого клетки трижды отмывают.

Стандартная смесь клеток: перед постановкой диагностического теста для исследования больного с предполагаемым иммунодефицитным состоянием необходимо установить границы "нормального ответа". Для этого необходимо учитывать целый ряд переменных величин. Желательно иметь стандартный препарат для получения максимальной аллогенной стимуляции. Для этого используют пул стимулирующих клеток, полученных: не менее чем от 10 различных доноров. Клетки могут сохраняться в замороженном состоянии. В таблице представлены этапы получения пула.

Низкотемпературная консервации без криостата

Низкотемпературная консервации без криостата

Выход клеток составляют около 70%.

Хотя данный метод замораживания и не является оптимальным, он вполне пригоден для сохранения клетками стимулирующей активности; для сохранения клеток респондера этот метод не применим.

Культивирование и обработка проб: Из рисунка выше видно, что в пробе смешивают 105 лимфоцитов респондера и 105 стимулирующих клеток. Продолжительность

культивирования составляет 7 дней. После внесения метки в культуру (см. рисунок выше) проводят обработку и измерение радиоактивности так же, как для реакции бласттрансформации лимфоцитов.

Оценка результатов

Оценку результатов проводят аналогично тому, как это принято для реакции бласттрансформации лимфоцитов (см. раздел «Реакция бласттрансформации лимфоцитов. Методика») либо по абсолютным показателям (имп/мин), либо по индексу стимуляции (ИС):